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序列捕获外显子组+二代测序NGS技术讲座ppt

 

测序的样品要求:
      测序由于是要进行特殊的PCR反应的,因此对样品的要求与其他试验的要求有所不同分别简述之:
      1. 样品的纯度:PCR具有短时间内高效的扩增能力,因此样品的纯度对反应有至关重要的影响。当样品不纯的时候,那些杂质会对实验结果产生干扰。这在PCR产物测序中表现的尤为明显,在测序结果上表现为峰图杂乱,过多的不可识别的碱基。
      2. 样品的量:尽管测序反应可以高效的扩增待测得模板,使得测序所需要的模板量大大降低,但是当最低限度的模板量也不能提供的话,会引起测序反应的异常,表现为无反应,峰图弱,或者反应中断等。
      3. 样品的形式:这里专指纯化的PCR产物和质粒样品。正常情况下,溶解样品时常用的溶液有以下几种形式:水,Tris 溶液,TE(Tris--EDTA)三种。当采用TE为溶剂的时候由于溶液中的EDTA可以干扰测序反应的进行,因此实验人员在进行测序时需要注意样品的溶解方式。
三、不同样品的要求及简介:
      1. 样品的形式:从测序角度来讲最好是由实验者提供菌液的形式,由公司来提取质粒,这样可以保证DNA样品的数量和质量。如果实验者提供的是质粒或者是纯化后的PCR产物,则需要说明其浓度和溶解的方式(原因如上)
      2. 不同样品的说明:
    (1)PCR产物:若是PCR产物进行测序时,需要实验者同时提供PCR的双向引物各10ul(浓度>5uM/ul),这是因为PCR的引物要求与测序的引物有所不同,因此不能保证一条PCR引物就能够测成功。双向引物可以在一条引物无法测序的情况下,改用另一端的引物测序。这样一来,最好实验者告知公司一下反应的条件,以便测序公司可以及时调整测序反应。
          (已纯化)浓度 > 50ng/μl、体积> 10 μl;
          (未纯化)浓度 > 100ng/μl、体积> 30 μl;
          引物要求:浓度>5uM、体积>10 μl
    (2)质粒产物:需要提供明确的质粒名称,大小、浓度以及测序所用的引物名称,如果是自带引物测序(条件同PCR测序),最好也能够标明反应的条件。质粒的大小对于测序也有着一定的影响。样品中,质粒的总量不低于5ug。
    (3)菌液:需要明确的标明所用的抗生素类型和培养条件,以便样品能够培养和扩增。

 

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